骨骼檢材DNA提取方法大PK

2021-12-29 11:07:30 來源：復鑒，點擊量：5436

從骨架化的人類遺體（尤其是從老化或混合的骨骼）中提取DNA，一直是人類學身份鑒定具有挑戰性的方面。2019年刊登在Journal of Forensic Sciences雜志上的Extractionof DNA from Skeletonized Postcranial Remains: A Discussion of Protocols andTesting Modalities回顧了1990年至2018年間由武裝部隊醫學檢查員-武裝部隊DNA鑒定實驗室進行的DNA分析實驗。對超過13,000種骨骼樣本通過四種不同的提取方法進行DNA提取，然后進行以下檢測：線粒體DNA測序，STR檢測（AmpFlSTRYfiler^TM，AmpFlSTR MiniFiler^TM，PowerPlex Fusion）及NGS，最后分別對四種提取方法、檢測方法的成功率進行分析。

研究選取了1999年-2018年間的國防部戰俘/軍事情報局（DPAA）和軍隊法醫系統的DNA鑒定實驗室內收集的樣本，樣本主要來源于軍事沖突戰爭遺骸（朝鮮戰爭、東南亞戰爭、一戰、二戰等）及非沖突時間（訓練事故等），均為無組織殘留的骨骼樣本。研究人員共使用了四種不同的DNA提取方案：

方法一、不完全脫鹽，加上有機提純；

方法二、通過有機純化完全脫鹽；

方法三、使用QIA quick PCR純化試劑盒通過無機純化完全脫鹽；

方法四、專為下一代測序設計的提取方法。

由此可見，提取方法對樣本的起始量要求在逐漸降低，從2.5g的起始量降低到了0.5g，文中提及目前最低起始量可達到0.05g。但四種方法的孵育溫度及條件依舊維持不變，操作細節上的區別主要有以下三點點：1.與之前方法一的順序不同，方法二和方法三均采用先濃縮后純化的方案；2. 純化的方法不同；3. 濃縮采用的耗材不同。

從方法上來說：

方法二更適用于線粒體DNA的檢測實驗，其成功率達到91%；方法三更適用于STR檢測實驗；研究人員分析方法一之所以成功率低可能有兩方面原因：一是因為其提取試劑中EDTA的含量較低；二是因為其所需的樣本起始量較高。而方法三在線粒體DNA方面表現不如方法二的原因可能是由于其濃縮過程使用的column更容易結合大片段DNA，降低了小片段DNA的結合效果。

從骨骼種類上來說：

股骨、腓骨、脛骨來源的樣本提取效果通常較好，各種方案均可以獲得較高的成功率；而掌骨、腳部骨骼等樣本的提取檢測效果相對較差，線粒體DNA的提取可以使用方法二和方法三，但STR的檢測中各類提取方案的檢測效果均很差。

圖1 人體骨骼結構圖

從STR檢測試劑盒上來說：

Power plex fusion試劑盒的檢測成功率顯著高于Mini filer和Y-filer，Mini-filer和Y-filer的設計初衷就是為了檢測降解樣本，但本研究發現在使用方法二進行提取的樣本檢測時，這兩個試劑盒的檢測成功率（52%和56%）顯著低于fusion（92%）。研究人員分析一結果的原因可能是由于實驗室內的操作誤差導致。同時研究人員也發現Fusion、mini-filer的檢測結果具有一致性，很少出現mini-filer檢測不出來而fusion可以檢測出的結果。

因此無論測試的骨骼來源如何，方法二是線粒體DNA測序的最佳提取方案；對于STR測試，方法三則可以提供更佳的結果。但方法的選擇取決于樣本的狀態、環境以及檢測的目的，必須根據實際情況進行綜合考慮。因此方法的選擇并非單一的“Yes”或者“No”，而是綜合因素考慮下的選擇。文中介紹的這四類方法也是最為基礎的方案，隨著科技的發展和樣本復雜度的提升，骨骼DNA的提取方法也在不斷地優化，以期望能進一步提高樣本的檢測成功率。

原文鏈接：

https://doi: 10.1111/1556-4029.14050

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