接觸痕是法醫(yī)實(shí)踐中最常見的微量樣本種類之一，在此前的文章中，我們介紹了法醫(yī)科學(xué)家們對接觸DNA來源探索的部分努力（脫落細(xì)胞？接觸DNA從哪里來？）。但受限于當(dāng)時的技術(shù)水平，以形態(tài)學(xué)為主的研究限制了結(jié)果的適用范圍和說服力。近年來，成熟的現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)越來越多的在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得以應(yīng)用，而法醫(yī)科學(xué)家們也始終沒有忽視對于接觸痕、脫落細(xì)胞的進(jìn)一步探索。2020年，倫敦國王學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)表題為Illuminating touch deposits throughcellular characterization of hand rinses and body fluids with nucleic acidfluorescence的文章，通過流式細(xì)胞術(shù)和顯微鏡觀察，研究了手部接觸脫落物的組成。

 

根據(jù)前人的文獻(xiàn)，接觸DNA的來源可能十分多樣化：一方面，盡管脫落的角質(zhì)細(xì)胞不含細(xì)胞核，但細(xì)胞外仍可能有游離的DNA的存在；另一方面，碎片化、降解的細(xì)胞也可能釋放游離的細(xì)胞核；最后，接觸脫落物也可能并非源自手上，而是手與其他更豐富的有核細(xì)胞源（如鼻子，眼睛或嘴巴）接觸后積累在手上的。多樣的來源使得實(shí)際樣本過于復(fù)雜、不可控，因而本次研究選取了5種受控的單一來源模擬接觸脫落物：

 

未洗過的手：志愿者用無菌PBS輕輕擦洗未清洗過的手，每次2ml，共6ml。將擦洗后的液體收集在無菌稱量皿中，并轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。

 

洗過的手：志愿者用肥皂洗手，并在自來水中徹底沖洗1-2分鐘，然后避免接觸，風(fēng)干。重復(fù)上一類樣品的收集流程。

 

唾液：志愿者在收集前至少1小時不吃不喝，用水短暫漱口后讓唾液在嘴中積聚幾分鐘。這樣做是為了最大程度地減少刮擦的頰細(xì)胞，而將收集的重點(diǎn)放在最有可能出現(xiàn)在可轉(zhuǎn)移唾液中的細(xì)胞上。隨后在無菌稱量皿中收集3ml唾液，并用3mlPBS稀釋。

 

鼻腔灌洗液：志愿者使用無菌一次性移液器，將每次2ml總共6ml的PBS加入自己的鼻腔（兩個鼻孔）中，在研究人員的指導(dǎo)下進(jìn)行鼻灌洗。在液體離開鼻腔、與外部皮膚接觸之前，將其收集在無菌稱量皿中。

 

洗眼液：志愿者使用無菌洗眼杯，用每次2ml總共6ml的PBS洗睜開的右眼，收集液體轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中

 

將每種樣品用以下每種條件染色：噻唑橙（TO，84nmol/L），碘化丙啶（PI，2.15μmol/L），DiamondDye（DD，1X），組合的TO/PI（84nmol/LTO，2.15μmol/LPI）。TO是一種可滲透細(xì)胞的花青染料，而PI則不會滲透到活的、完整的細(xì)胞中。兩者都將在核酸結(jié)合后發(fā)出熒光，并廣泛用于顯微鏡和流式細(xì)胞儀中。一起使用時，可以區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，或完整細(xì)胞和受損細(xì)胞。DD是一種DNA結(jié)合染料，用于檢測電泳凝膠中的核酸。

圖1. 在流式細(xì)胞儀上單個樣本的每種樣品類型的FSC v. SSC圖。X軸表示前向散射（大小），Y軸表示側(cè)向散射（粒度）。大小按色彩分類（綠色：6μm以下，粉紅色：6–10μm，藍(lán)色在10-15μm，紅色：在15μm以上）。

所有樣品類型均顯示出高密度的小、低粒度事件，說明有大量碎片；然后是分布更大的大粒度事件，反映完整的細(xì)胞。圖1可見接觸脫落物中，既有完整細(xì)胞大?。?5–50μm），也有更小的（通常低于10μm）細(xì)胞碎片、體液中的游離細(xì)胞核、白細(xì)胞等。

 

圖1中唾液、洗過的手和未洗過的手都包含相對較大的細(xì)胞群，而洗眼和洗鼻樣本的大型細(xì)胞數(shù)量較低，且總體細(xì)胞密度較低，這可能是由于收集這些樣品時缺乏摩擦所致。而同樣摩擦少的唾液細(xì)胞密度更高，可能表明口腔粘膜比鼻子或眼睛更容易脫落細(xì)胞。

 

總體而言，單一樣本的細(xì)胞分布差別不夠大，不足以通過細(xì)胞分布來揭示復(fù)雜的脫落沉積物的主要來源。

                                                                                                圖2. 同一名志愿者5天中洗過的手樣本的FSC v. SSC圖。

                                                                                                     圖3. 6名志愿者洗過的手樣本的FSC v. SSC圖。

為了評估每日變化對每個被檢查的體液中單個細(xì)胞脫落的影響，在5天中分別采樣，所有樣本沒有顯著差異（p>0.05）。而在不同個體中，大于15μm的大細(xì)胞事件的百分比范圍從7.4％至57.2％，任何兩個捐贈者的大細(xì)胞群體百分比之間的最大差異平均值為30.9％，這比每個個體中最大差異的平均值高18.9％，但仍沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（p=0.12）。

 

使用熒光核酸染料來定位樣品中的DNA，即確定哪些大小的細(xì)胞或片段包含遺傳物質(zhì)。熒光強(qiáng)度高于未染色對照樣品的測量自身熒光強(qiáng)度的任何顆?；蚣?xì)胞即認(rèn)為是“ DNA（+）”，因?yàn)樗鼈兊臒晒獗砻鞔嬖诤怂帷?

圖4. PI染色的唾液的FSC v. SSC圖（左上）顯示了角質(zhì)形成細(xì)胞簇（>15μm）和白細(xì)胞/碎片（<10μm）。紅色表示檢測到的核酸熒光高于黑色（左下）所示的自然自發(fā)熒光水平。特寫（右）顯示唾液中存在DNA+事件，與白細(xì)胞、保留DNA的降解細(xì)胞或游離核一致。

圖5. 左：PI染色的洗過的手樣本的FSC v. SSC圖（左上）顯示角質(zhì)形成細(xì)胞簇（>15μm）和白細(xì)胞/碎片（<10μm）。紅色表示檢測到的核酸熒光高于黑色（左下）所示的自然自發(fā)熒光水平。特寫（右）顯示很少的DNA+事件。

右：未洗過的手樣本的分布和熒光圖相同。特寫（右）顯示出有限的含核酸碎片，比唾液中可觀察到的碎片要少得多，比洗過的手樣本多。

所有樣本都做了核酸染色，其中洗過的手對接觸脫落物的含量信息最多，而唾液有望包含全部潛在的DNA來源（即完整的有核細(xì)胞，無核角質(zhì)細(xì)胞，小白細(xì)胞，游離核和降解的細(xì)胞片段）。

 

對于唾液樣本，TO不僅染色了角質(zhì)形成細(xì)胞（>15μm），還對大部分小細(xì)胞/碎片（6-15μm）進(jìn)行了染色，這可能是由于存在大量白細(xì)胞。PI染色則表明大多數(shù)細(xì)胞被破壞且含有DNA。

 

而對于洗過的手樣本，其DNA+幾乎完全位于大細(xì)胞大小區(qū)域中。在PI或TO染色的小細(xì)胞/片段大小范圍內(nèi)幾乎沒有DNA+事件發(fā)生（圖5）。這表明洗手液中游離核或含有DNA的細(xì)胞碎片的發(fā)生率受到限制。

 

有趣的是，在洗過的手和未洗過的手中都觀察到了相似的結(jié)果，表明手上并沒有積累很多富含DNA的生物材料，接觸DNA實(shí)際上可能是無細(xì)胞的游離DNA或由完整的細(xì)胞（如無核角質(zhì)細(xì)胞）提供。

圖6. 六種樣品類型（從上至下：洗手、未洗手、唾液、洗鼻液、洗眼液，陽性對照：培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞）用三種核酸染料染色（從左至右：碘化丙啶，噻唑橙、DiamondDye）。樣品以200×檢查。比例尺代表30μm。

顯微鏡觀察洗過的和未洗過的手樣本顯示出大量的雙熒光無核角質(zhì)細(xì)胞，它們也存在于唾液中，很少出現(xiàn)在洗眼液和洗鼻液中。有核上皮細(xì)胞僅在唾液中完全可見。鼻腔灌洗顯示偶有角質(zhì)細(xì)胞和一些不規(guī)則的熒光，可能是具有彌散性核酸的粘液；在兩個樣品中，DiamondDye觀察到小的明亮的白細(xì)胞。洗眼液包含的細(xì)胞很少（與流式細(xì)胞術(shù)一致），僅包含稀有的熒光顆粒。當(dāng)在洗眼液和洗鼻液中看到熒光時，它通常是很小的顆粒或廣泛的低強(qiáng)度涂片，而不是可識別的細(xì)胞。

 

在顯微鏡下觀察到的任何角質(zhì)細(xì)胞中都缺乏核，然而這些無核細(xì)胞確實(shí)對多種核酸染料的DNA呈陽性。脫落的角質(zhì)細(xì)胞的角質(zhì)包膜似乎不能防止PI染色。這可能是因?yàn)榻琴|(zhì)細(xì)胞死亡并脫落，因此它們的膜是可滲透的。另一種可能性是，角質(zhì)細(xì)胞的核酸染色反映了小的、膜結(jié)合的DNA片段的存在，這些片段可能是從汗液中存在的游離DNA中結(jié)合的。

流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)和顯微鏡觀察到的角質(zhì)細(xì)胞中的DNA+染色結(jié)果，揭示了無核細(xì)胞含有大量DNA。終末分化期，間核和其他細(xì)胞器（尤其是包含DNA的線粒體）的降解可能會在角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)留下殘留的核酸。需要注意的是，這些DNA和無細(xì)胞游離DNA一樣，可能存在高度片段化的情況，對于標(biāo)準(zhǔn)法醫(yī)STR完整擴(kuò)增貢獻(xiàn)有限，但其豐富的含量完全值得通過其方法（例如SNP）加以利用，使其成為接觸DNA證據(jù)有價(jià)值的附加來源。

 

流式細(xì)胞術(shù)在小細(xì)胞/碎片大小的數(shù)據(jù)表面，盡管碎片是接觸脫落物中占據(jù)較大比例，但它并不包含大量的DNA陽性碎片細(xì)胞或游離核。盡管在顯微鏡下檢查的樣本可能沒有捕獲到所有DNA（+）細(xì)胞片段，但這些數(shù)據(jù)表明碎片對接觸沉積物的DNA含量貢獻(xiàn)有限。因此，在DNA提取中過濾、除雜的過程中，即使將分離尺徑縮小至6-15μm也幾乎不會增加DNA損失的風(fēng)險(xiǎn)。

 

原文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.fsigen.2020.102269