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骨骼檢材DNA提取方法大PK

2021-12-29 11:07:30 來源:復(fù)鑒,點(diǎn)擊量:5439

從骨架化的人類遺體(尤其是從老化或混合的骨骼)中提取DNA,一直是人類學(xué)身份鑒定具有挑戰(zhàn)性的方面。2019年刊登在Journal of Forensic Sciences雜志上的Extractionof DNA from Skeletonized Postcranial Remains: A Discussion of Protocols andTesting Modalities回顧了1990年至2018年間由武裝部隊(duì)醫(yī)學(xué)檢查員-武裝部隊(duì)DNA鑒定實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的DNA分析實(shí)驗(yàn)。對超過13,000種骨骼樣本通過四種不同的提取方法進(jìn)行DNA提取,然后進(jìn)行以下檢測:線粒體DNA測序,STR檢測(AmpFlSTRYfilerTM,AmpFlSTR MiniFilerTM,PowerPlex Fusion)及NGS,最后分別對四種提取方法、檢測方法的成功率進(jìn)行分析。


研究選取了1999年-2018年間的國防部戰(zhàn)俘/軍事情報(bào)局(DPAA)和軍隊(duì)法醫(yī)系統(tǒng)的DNA鑒定實(shí)驗(yàn)室內(nèi)收集的樣本,樣本主要來源于軍事沖突戰(zhàn)爭遺骸(朝鮮戰(zhàn)爭、東南亞戰(zhàn)爭、一戰(zhàn)、二戰(zhàn)等)及非沖突時(shí)間(訓(xùn)練事故等),均為無組織殘留的骨骼樣本。研究人員共使用了四種不同的DNA提取方案:
方法一、不完全脫鹽,加上有機(jī)提純;
方法二、通過有機(jī)純化完全脫鹽;
方法三、使用QIA quick PCR純化試劑盒通過無機(jī)純化完全脫鹽;
方法四、專為下一代測序設(shè)計(jì)的提取方法。

由此可見,提取方法對樣本的起始量要求在逐漸降低,從2.5g的起始量降低到了0.5g,文中提及目前最低起始量可達(dá)到0.05g。但四種方法的孵育溫度及條件依舊維持不變,操作細(xì)節(jié)上的區(qū)別主要有以下三點(diǎn)點(diǎn):1.與之前方法一的順序不同,方法二和方法三均采用先濃縮后純化的方案;2. 純化的方法不同;3. 濃縮采用的耗材不同。


從方法上來說:
方法二更適用于線粒體DNA的檢測實(shí)驗(yàn),其成功率達(dá)到91%;方法三更適用于STR檢測實(shí)驗(yàn);研究人員分析方法一之所以成功率低可能有兩方面原因:一是因?yàn)槠涮崛≡噭┲蠩DTA的含量較低;二是因?yàn)槠渌璧臉颖酒鹗剂枯^高。而方法三在線粒體DNA方面表現(xiàn)不如方法二的原因可能是由于其濃縮過程使用的column更容易結(jié)合大片段DNA,降低了小片段DNA的結(jié)合效果。



從骨骼種類上來說:
股骨、腓骨、脛骨來源的樣本提取效果通常較好,各種方案均可以獲得較高的成功率;而掌骨、腳部骨骼等樣本的提取檢測效果相對較差,線粒體DNA的提取可以使用方法二和方法三,但STR的檢測中各類提取方案的檢測效果均很差。


       圖1 人體骨骼結(jié)構(gòu)圖

從STR檢測試劑盒上來說:
Power plex fusion試劑盒的檢測成功率顯著高于Mini filer和Y-filer,Mini-filer和Y-filer的設(shè)計(jì)初衷就是為了檢測降解樣本,但本研究發(fā)現(xiàn)在使用方法二進(jìn)行提取的樣本檢測時(shí),這兩個(gè)試劑盒的檢測成功率(52%和56%)顯著低于fusion(92%)。研究人員分析一結(jié)果的原因可能是由于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的操作誤差導(dǎo)致。同時(shí)研究人員也發(fā)現(xiàn)Fusion、mini-filer的檢測結(jié)果具有一致性,很少出現(xiàn)mini-filer檢測不出來而fusion可以檢測出的結(jié)果。

因此無論測試的骨骼來源如何,方法二是線粒體DNA測序的最佳提取方案;對于STR測試,方法三則可以提供更佳的結(jié)果。但方法的選擇取決于樣本的狀態(tài)、環(huán)境以及檢測的目的,必須根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行綜合考慮。因此方法的選擇并非單一的“Yes”或者“No”,而是綜合因素考慮下的選擇。文中介紹的這四類方法也是最為基礎(chǔ)的方案,隨著科技的發(fā)展和樣本復(fù)雜度的提升,骨骼DNA的提取方法也在不斷地優(yōu)化,以期望能進(jìn)一步提高樣本的檢測成功率。

原文鏈接:
https://doi: 10.1111/1556-4029.14050



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