接觸痕是法醫(yī)實踐中最常見的微量樣本種類之一，在此前的文章中，我們介紹了法醫(yī)科學家們對接觸DNA來源探索的部分努力（脫落細胞？接觸DNA從哪里來？）。但受限于當時的技術水平，以形態(tài)學為主的研究限制了結果的適用范圍和說服力。近年來，成熟的現(xiàn)代生物學技術越來越多的在法醫(yī)學領域得以應用，而法醫(yī)科學家們也始終沒有忽視對于接觸痕、脫落細胞的進一步探索。2020年，倫敦國王學院的研究團隊發(fā)表題為Illuminating touch deposits throughcellular characterization of hand rinses and body fluids with nucleic acidfluorescence的文章，通過流式細胞術和顯微鏡觀察，研究了手部接觸脫落物的組成。

 

根據(jù)前人的文獻，接觸DNA的來源可能十分多樣化：一方面，盡管脫落的角質細胞不含細胞核，但細胞外仍可能有游離的DNA的存在；另一方面，碎片化、降解的細胞也可能釋放游離的細胞核；最后，接觸脫落物也可能并非源自手上，而是手與其他更豐富的有核細胞源（如鼻子，眼睛或嘴巴）接觸后積累在手上的。多樣的來源使得實際樣本過于復雜、不可控，因而本次研究選取了5種受控的單一來源模擬接觸脫落物：

 

未洗過的手：志愿者用無菌PBS輕輕擦洗未清洗過的手，每次2ml，共6ml。將擦洗后的液體收集在無菌稱量皿中，并轉移至1.5ml離心管中。

 

洗過的手：志愿者用肥皂洗手，并在自來水中徹底沖洗1-2分鐘，然后避免接觸，風干。重復上一類樣品的收集流程。

 

唾液：志愿者在收集前至少1小時不吃不喝，用水短暫漱口后讓唾液在嘴中積聚幾分鐘。這樣做是為了最大程度地減少刮擦的頰細胞，而將收集的重點放在最有可能出現(xiàn)在可轉移唾液中的細胞上。隨后在無菌稱量皿中收集3ml唾液，并用3mlPBS稀釋。

 

鼻腔灌洗液：志愿者使用無菌一次性移液器，將每次2ml總共6ml的PBS加入自己的鼻腔（兩個鼻孔）中，在研究人員的指導下進行鼻灌洗。在液體離開鼻腔、與外部皮膚接觸之前，將其收集在無菌稱量皿中。

 

洗眼液：志愿者使用無菌洗眼杯，用每次2ml總共6ml的PBS洗睜開的右眼，收集液體轉移到1.5ml離心管中

 

將每種樣品用以下每種條件染色：噻唑橙（TO，84nmol/L），碘化丙啶（PI，2.15μmol/L），DiamondDye（DD，1X），組合的TO/PI（84nmol/LTO，2.15μmol/LPI）。TO是一種可滲透細胞的花青染料，而PI則不會滲透到活的、完整的細胞中。兩者都將在核酸結合后發(fā)出熒光，并廣泛用于顯微鏡和流式細胞儀中。一起使用時，可以區(qū)分活細胞和死細胞，或完整細胞和受損細胞。DD是一種DNA結合染料，用于檢測電泳凝膠中的核酸。

圖1. 在流式細胞儀上單個樣本的每種樣品類型的FSC v. SSC圖。X軸表示前向散射（大?。琘軸表示側向散射（粒度）。大小按色彩分類（綠色：6μm以下，粉紅色：6–10μm，藍色在10-15μm，紅色：在15μm以上）。

所有樣品類型均顯示出高密度的小、低粒度事件，說明有大量碎片；然后是分布更大的大粒度事件，反映完整的細胞。圖1可見接觸脫落物中，既有完整細胞大?。?5–50μm），也有更小的（通常低于10μm）細胞碎片、體液中的游離細胞核、白細胞等。

 

圖1中唾液、洗過的手和未洗過的手都包含相對較大的細胞群，而洗眼和洗鼻樣本的大型細胞數(shù)量較低，且總體細胞密度較低，這可能是由于收集這些樣品時缺乏摩擦所致。而同樣摩擦少的唾液細胞密度更高，可能表明口腔粘膜比鼻子或眼睛更容易脫落細胞。

 

總體而言，單一樣本的細胞分布差別不夠大，不足以通過細胞分布來揭示復雜的脫落沉積物的主要來源。

                                                                                                圖2. 同一名志愿者5天中洗過的手樣本的FSC v. SSC圖。

                                                                                                     圖3. 6名志愿者洗過的手樣本的FSC v. SSC圖。

為了評估每日變化對每個被檢查的體液中單個細胞脫落的影響，在5天中分別采樣，所有樣本沒有顯著差異（p>0.05）。而在不同個體中，大于15μm的大細胞事件的百分比范圍從7.4％至57.2％，任何兩個捐贈者的大細胞群體百分比之間的最大差異平均值為30.9％，這比每個個體中最大差異的平均值高18.9％，但仍沒有達到統(tǒng)計學顯著差異（p=0.12）。

 

使用熒光核酸染料來定位樣品中的DNA，即確定哪些大小的細胞或片段包含遺傳物質。熒光強度高于未染色對照樣品的測量自身熒光強度的任何顆粒或細胞即認為是“ DNA（+）”，因為它們的熒光表明存在核酸。

圖4. PI染色的唾液的FSC v. SSC圖（左上）顯示了角質形成細胞簇（>15μm）和白細胞/碎片（<10μm）。紅色表示檢測到的核酸熒光高于黑色（左下）所示的自然自發(fā)熒光水平。特寫（右）顯示唾液中存在DNA+事件，與白細胞、保留DNA的降解細胞或游離核一致。

圖5. 左：PI染色的洗過的手樣本的FSC v. SSC圖（左上）顯示角質形成細胞簇（>15μm）和白細胞/碎片（<10μm）。紅色表示檢測到的核酸熒光高于黑色（左下）所示的自然自發(fā)熒光水平。特寫（右）顯示很少的DNA+事件。

右：未洗過的手樣本的分布和熒光圖相同。特寫（右）顯示出有限的含核酸碎片，比唾液中可觀察到的碎片要少得多，比洗過的手樣本多。

所有樣本都做了核酸染色，其中洗過的手對接觸脫落物的含量信息最多，而唾液有望包含全部潛在的DNA來源（即完整的有核細胞，無核角質細胞，小白細胞，游離核和降解的細胞片段）。

 

對于唾液樣本，TO不僅染色了角質形成細胞（>15μm），還對大部分小細胞/碎片（6-15μm）進行了染色，這可能是由于存在大量白細胞。PI染色則表明大多數(shù)細胞被破壞且含有DNA。

 

而對于洗過的手樣本，其DNA+幾乎完全位于大細胞大小區(qū)域中。在PI或TO染色的小細胞/片段大小范圍內幾乎沒有DNA+事件發(fā)生（圖5）。這表明洗手液中游離核或含有DNA的細胞碎片的發(fā)生率受到限制。

 

有趣的是，在洗過的手和未洗過的手中都觀察到了相似的結果，表明手上并沒有積累很多富含DNA的生物材料，接觸DNA實際上可能是無細胞的游離DNA或由完整的細胞（如無核角質細胞）提供。

圖6. 六種樣品類型（從上至下：洗手、未洗手、唾液、洗鼻液、洗眼液，陽性對照：培養(yǎng)的角質形成細胞）用三種核酸染料染色（從左至右：碘化丙啶，噻唑橙、DiamondDye）。樣品以200×檢查。比例尺代表30μm。

顯微鏡觀察洗過的和未洗過的手樣本顯示出大量的雙熒光無核角質細胞，它們也存在于唾液中，很少出現(xiàn)在洗眼液和洗鼻液中。有核上皮細胞僅在唾液中完全可見。鼻腔灌洗顯示偶有角質細胞和一些不規(guī)則的熒光，可能是具有彌散性核酸的粘液；在兩個樣品中，DiamondDye觀察到小的明亮的白細胞。洗眼液包含的細胞很少（與流式細胞術一致），僅包含稀有的熒光顆粒。當在洗眼液和洗鼻液中看到熒光時，它通常是很小的顆粒或廣泛的低強度涂片，而不是可識別的細胞。

 

在顯微鏡下觀察到的任何角質細胞中都缺乏核，然而這些無核細胞確實對多種核酸染料的DNA呈陽性。脫落的角質細胞的角質包膜似乎不能防止PI染色。這可能是因為角質細胞死亡并脫落，因此它們的膜是可滲透的。另一種可能性是，角質細胞的核酸染色反映了小的、膜結合的DNA片段的存在，這些片段可能是從汗液中存在的游離DNA中結合的。

流式細胞術的數(shù)據(jù)和顯微鏡觀察到的角質細胞中的DNA+染色結果，揭示了無核細胞含有大量DNA。終末分化期，間核和其他細胞器（尤其是包含DNA的線粒體）的降解可能會在角質細胞內留下殘留的核酸。需要注意的是，這些DNA和無細胞游離DNA一樣，可能存在高度片段化的情況，對于標準法醫(yī)STR完整擴增貢獻有限，但其豐富的含量完全值得通過其方法（例如SNP）加以利用，使其成為接觸DNA證據(jù)有價值的附加來源。

 

流式細胞術在小細胞/碎片大小的數(shù)據(jù)表面，盡管碎片是接觸脫落物中占據(jù)較大比例，但它并不包含大量的DNA陽性碎片細胞或游離核。盡管在顯微鏡下檢查的樣本可能沒有捕獲到所有DNA（+）細胞片段，但這些數(shù)據(jù)表明碎片對接觸沉積物的DNA含量貢獻有限。因此，在DNA提取中過濾、除雜的過程中，即使將分離尺徑縮小至6-15μm也幾乎不會增加DNA損失的風險。

 

原文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.fsigen.2020.102269