由于DNA的熱變性，嚴重焚燒的人類遺體樣本通常DNA產量低、片段小，因而難以得到理想的STR分型，這對法醫學研究提出了特殊的挑戰。而另一方面，古生物學家長期致力于從降解的考古標本中提取DNA，其形成的方法在短片段提取中已得到有效證明。為了驗證古DNA提取方法是否可以應用于法醫實踐，美國亞利桑那州立大學人類進化和生物考古學的研究團隊與馬里科帕縣法醫辦公室合作，對火災案件中多種骨骼樣本分別使用Dabney等人發表過的古DNA提取方法和Loreille等人發表過的法醫骨DNA提取方法進行提取，比較DNA產量和STR圖譜的完整性。

作者對23個來自車輛，房屋火災和火葬場的個體進行采樣，樣本包括顱骨（頂骨和顳骨碎片）、趾骨、跖骨、掌骨、脛骨和前臼齒，并根據燃燒溫度導致的骨變色程度進行分類：I：保存良好/中等；II：黃色或棕色（200-300℃）；III：黑色或熏制（300-550℃）；IV：灰色（550-650℃）；V：煅燒成灰（>650℃）。使用金剛石切割輪切割骨頭碎片，然后用錘子粉碎。

                                                                                                       表1. 不同燃燒程度的樣本

Loreille的法醫骨DNA提取方法：

每份骨粉在15ml離心管中用3mL 0.5M EDTA，52μl N-月桂酰肌氨酸鈉（0.5％）和100μl蛋白酶K（20mg/mL）組成的緩沖液完全脫鹽并裂解，室溫孵育24小時；

3000 x g離心1分鐘，取上清；

用裝有Ultracel-PL 30-kDa膜的Amicon Ultra 4離心裝置將上清液濃縮至≤100μl；

用MinElute?PCR Purification Kit柱純化濃縮的上清液；

用25μl EB洗脫兩輪，保存在-20℃。

Dabney的古DNA提取方法：

每份骨粉在1mL 0.5M EDTA中進行軟化處理，室溫震蕩孵育24小時，將上清液轉移至到2mL MAXYMum Recovery PCR管中；

在骨粉沉淀的管中加入1ml由1％聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）、2.5mM N-吩噻唑溴化銨（PTB）、5mM氯化鈣（CaCl2）、50mM二硫蘇糖醇（DTT）、20mM Tris-HCl（pH 8.0）、0.5％N-月桂酰肌氨酸鈉和20mg/mL蛋白酶K組成的裂解緩沖液進行消化，25℃金屬浴孵育24小時；

最大速度離心30秒，將上清液轉移至之前裝有1mL脫鹽上清的管中，每個樣品中總共有2 mL脫鹽和裂解的上清液；

對沉淀重復上述流程，使每個樣品的脫鹽和裂解的上清液總量達到4mL。

每次用1mL上清液與13mL由5M鹽酸胍（GuHCl）、90mM乙酸鈉（pH5.2）、Tween-20和40％異丙醇組成的結合緩沖液充分混合，用Zymo-SpinV柱純化；

得到的上清液用MinElute?PCR Purification Kit柱再次純化；

用25μl EB洗脫兩輪，保存在-20℃。

提取的DNA用Quantifiler? Trio DNA RT-PCR Quantification Kit定量試劑盒，對常染色體上一種多拷貝的大片段（LA：214bp）和小片段（SA：80bp）區域進行檢測，以確定DNA的濃度和降解情況，并根據LA：SA的比值計算DNA平均降解指數DIM。7500 Real-time PCR system對DNA總量進行定量。

最后用PowerPlex® ESX 17試劑盒擴增，比較不同提取方法對STR結果的影響，并用GlobalFiler?復核確認結果準確。

                                                                                                                                表2-1. 定量結果

                                                                          圖1.不同燃燒等級樣品的平均DNA濃度（ng/μl）

結果顯示，從平均DNA產量上來看，兩種方法總體差別不大，產量與溫度升高之間不出所料呈負相關。Loreille的全骨脫鹽提取法似乎對II類燃燒樣品效果更顯著，而在IV類燃燒樣品中釋放的更多的小片段。

圖2. 不同樣本類型（依次為跖骨、頂骨，脛骨、指骨、掌骨、前臼齒、橈骨和顳骨）平均DNA濃度（ng/μl）

如圖2所示，兩種方法都成功從跖骨、頂骨、脛骨、指骨和掌骨中提取了一定量的DNA，不同方法在不同類型的樣本上表現差異較大。對于兩個前臼齒，使用Dabney方法提取了平均0.07ng/μl的DNA，而Loreille方法沒能提取成功。從兩個脛骨樣本（平均DNA產量= 0.002ng/ul）和顳骨碎片（Dabney提取平均產量0.0002 ng/ul；Loreille提取平均產量0.00002 ng/ul）中只檢測到極微量的DNA。此次實驗中長骨、顱骨和手骨是最佳的DNA來源，這可能是皮質骨致密的結構完整性所造成的。

                                                                                                                                                                         表2-2. STR結果

                              3. 不同方法提取不同燃燒等級樣本所得到的STR圖譜數量

從提取結果中選擇兩種方法各40個，共80個進行STR分型，共得到48個完整的STR圖譜，其中46個來自I-III類樣本，說明對燃燒溫度>350℃的樣本STR顯著降解。Dabney的古DNA法在更高燃燒等級的樣本中獲得了幾個樣本的部分STR圖譜。根據不同片段大小STR圖譜峰值判斷DNA的降解情況。

對燃燒等級IV、V的樣本由于降解嚴重，片段較短的mini-STR和midi-STR更有可能檢出峰值。此時，Dabney的古DNA法取得了更好的效果。例如對于V類燃燒，Dabney提取的ASU_0022_cat5樣本所有三個mini-STR、加上一個midi-STR（D12s391）以及至少兩個其他較長的基因座均顯示等位基因，而同一樣本用Loreille提取僅在一個mini-STR有峰。

圖4. 兩個V級燃燒（>650℃）樣本的部分STR結果。上面是Dabney的古DNA方法，下面是Loreille的法醫DNA方法

總體來看，受限于法醫面臨不同樣本的復雜情況，很難總結出一種適用于所有情況的最佳方法。但是在某些案例中（例如燃燒嚴重的特定骨骼樣本），使用古DNA提取方法可以提高獲得更高質量的DNA和更完整的STR圖譜的成功率。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.fsigen.2020.102272